IGF-1 LR3 مجفف بالتجميد,The freeze-dried long-acting insulin-like growth factor-1 LR3 formulation uses low-temperature vacuum drying technology to remove moisture, preventing peptide degradation or aggregation in liquid formulations and extending the shelf life (usually up to 2 years at -20 ℃). It can be directly used after reconstitution, reducing transportation and storage costs. At the same time, the freeze-drying process can remove impurities and improve the purity of the formulation (usually>95٪). ومع ذلك، قد يؤدي الاستخدام طويل الأمد- إلى إزالة حساسية المستقبلات ويتطلب إدارة متقطعة. الجرعات العالية قد تسبب نقص السكر في الدم، ويجب مراقبة مستويات السكر في الدم.
نحن لا نقدم فقط مسحوقًا وكبسولات نقية، ولكن أيضًا أشكال جرعات أخرى. إذا لزم الأمر، يرجى الاتصال بفريق المبيعات لدينا.
منتجاتنا من
IGF-1 LR3 كوا
استنساخ الجينات وبناء ناقلات التعبير
التصميم الجيني لIGF-1 LR3 مجفف بالتجميديعتمد على تسلسل IGF-1 الطبيعي، ولكن مع التعديلات الرئيسية التالية:
N-امتداد طرفي: أضف 13 من الأحماض الأمينية (MFPAMPLSSLFFN) إلى N-طرف IGF-1 لإطالة عمر النصف وتعزيز نشاطه البيولوجي.
استبدال الأحماض الأمينية: استبدل حمض الجلوتاميك (Glu) في الموضع 3 من IGF-1 بالأرجينين (Arg)، أي تعديل R3، لتقليل القدرة على الارتباط بـ IGFBP وزيادة التركيز الحر.
تخليق الجينات
الحصول على جزء الجين المستهدف من خلال التوليف الكيميائي أو تضخيم PCR استنادًا إلى تسلسل الجينات IGF-1 LR3 المصمم. عادةً ما يعتمد التخليق الكيميائي تقنية تخليق الطور الصلب، ويضيف النيوكليوتيدات تدريجيًا، وأخيرًا يتم تصنيع أجزاء الجينات الكاملة. يستخدم تضخيم PCR تسلسلات IGF-1 المعروفة لتصميم الاشعال وتضخيم الجين المستهدف من خلال تفاعل PCR.
يعد اختيار ناقل التعبير المناسب خطوة حاسمة في التعبير عن البروتين. تتضمن ناقلات التعبير شائعة الاستخدام سلسلة pET (مثل pET30a)، وسلسلة pGEX، وما إلى ذلك. تحتوي هذه المتجهات على مروجين فعالين، ومواقع استنساخ متعددة، وتسلسلات علامات (مثل علاماته)، مما يسهل تنقية البروتين واكتشافه لاحقًا.
على سبيل المثال، خطوات بناء متجه التعبير pET30a هي كما يلي:
الانقسام الأنزيمي: استخدم نوكليازات التقييد الداخلية مثل BamHI وXhoI لإجراء انقسام إنزيم مزدوج على ناقل pET32a وجزء الجين IGF-1 LR3، مما ينتج نهايات لزجة تكميلية.
الاتصال: يتم توصيل ناقل الإنزيم المهضوم وجزء الجين بواسطة T4 DNA ligase لتكوين ناقل التعبير المؤتلف pET32a-LR3-IGF1.
التحول: تحويل ناقل التعبير المؤتلف إلى خلايا E. coli المختصة (مثل DH5) والحصول على استنساخ إيجابي من خلال فحص المضادات الحيوية (مثل الأمبيسيلين).
تحديد الهوية: تأكيد صحة ناقل التعبير المؤتلف من خلال طرق مثل مستعمرة PCR، أو تحديد هضم الإنزيم، أو التسلسل.
تعبير البروتين
اختيار سلالات التعبير
يعد اختيار سلالة التعبير المناسبة أمرًا بالغ الأهمية للتعبير عن البروتين. تشمل سلالات التعبير شائعة الاستخدام روزيتا (DE3)، BL21 (DE3)، إلخ. تحتوي هذه السلالات على أنظمة بوليميراز T7 RNA فعالة ويمكنها التعبير بكفاءة عن الجينات التي يقودها مروج T7.
إذا أخذنا رشيد (DE3) كمثال، فإن خصائصه تشمل: احتوائه على جين بوليميريز T7 RNA، الناجم عن تعبير IPTG. إن حمل جينات الحمض الريبي النووي النقال الكودوني النادر يمكن أن يعبر بكفاءة عن الجينات الخارجية التي تحتوي على أكواد نادرة. مناسبة للتعبير عن البروتينات السامة أو البروتينات التي يصعب التعبير عنها.
تحسين ظروف التعبير
إن ظروف التعبير البروتيني، مثل تركيز المحفز، ودرجة حرارة الحث، ووقت الحث، وما إلى ذلك، لها تأثير كبير على إنتاج البروتين وجودته. من خلال تحسين شروط التعبير، يمكن زيادة مستوى التعبير عن IGF-1 LR3.
تركيز العامل المحفز: IPTG هو عامل محفز شائع الاستخدام، بتركيز يتراوح عادة بين 0.1-1 ملم. تحديد تركيز IPTG الأمثل من خلال تجارب التدرج لتحقيق أعلى مستوى من التعبير البروتين.
درجة حرارة الحث: عادة ما يتم اختيار درجة حرارة الحث بين 16-37 درجة. يمكن أن تساعد درجات الحرارة المنخفضة (مثل 16-20 درجة) في تقليل تحلل البروتين وتكوين الجسم، وزيادة إنتاج البروتينات القابلة للذوبان.
وقت الحث: وقت الحث عادة ما يكون بين 2-24 ساعة، ويتم تحديد وقت الحث الأمثل من خلال تحليل مستويات التعبير البروتيني من خلال أخذ العينات في الوقت المناسب.
الكشف عن التعبير البروتيني
التعبير عنIGF-1 LR3 مجفف بالتجميدتم اكتشافه بواسطة SDS-PAGE وطرق اللطخة الغربية.
SDS-PAGE: جمع العينات البكتيرية قبل وبعد الحث، وإجراء التجزئة بالموجات فوق الصوتية أو التحلل الكيميائي، وأجهزة الطرد المركزي لفصل الطاف والرواسب، وإجراء تحليل SDS-PAGE بشكل منفصل. من خلال مقارنة التغيرات في نطاقات البروتين في المادة طافية والراسبة قبل وبعد الحث، تم تأكيد التعبير عن IGF-1 LR3.
لطخة غربية: استخدم أجسامًا مضادة محددة (مثل الأجسام المضادة لعلامته أو الأجسام المضادة لـ IGF-1) لإجراء تحليل المناعي على البروتينات المنفصلة عن SDS-PAGE لتأكيد التعبير والوزن الجزيئي لـ IGF-1 LR3.
تنقية البروتين
التحلل البكتيري
جمع الخلايا البكتيرية المستحثة وليز لهم للافراج عن البروتينات داخل الخلايا. تشتمل طرق التكسير الشائعة على التجزئة بالموجات فوق الصوتية، وتجانس الضغط العالي-، والتكسير الكيميائي، وما إلى ذلك. وبأخذ التجزئة بالموجات فوق الصوتية كمثال، فإن الخطوات هي كما يلي:
جمع البكتيريا: الطرد المركزي للمحلول البكتيري المستحث للتعبير لجمع الخلايا البكتيرية، وإعادة تعليقها في المخزن المؤقت للتحلل (مثل PBS أو Tris HCl المخزن المؤقت).
التجزئة بالموجات فوق الصوتية: يتم وضع المعلق البكتيري في حمام جليدي ويتم سحقه باستخدام جهاز تعطيل بالموجات فوق الصوتية، عادةً باستخدام طريقة تجزئة متعددة قصيرة المدى- (مثل 10 ثوانٍ في كل مرة، وفاصل زمني 10 ثوانٍ، والتكرار 10 مرات) لتجنب تمسخ البروتين بسبب ارتفاع درجة الحرارة.
الفصل بالطرد المركزي: قم بالطرد المركزي للتعليق البكتيري المسحوق لفصل المادة الطافية والرواسب. يحتوي الطاف على بروتينات قابلة للذوبان، بينما قد يحتوي الراسب على أجسام متضمنة أو حطام خلية.
اللوني تقارب
ونظرًا لحقيقة أن IGF-1 LR3 المؤتلف يحمل عادةً علامة His، فيمكن تنقيته باستخدام كروماتوجرافيا تقارب أيون النيكل (Ni NTA).
إعداد العمود: تحميل التعبئة ني NTA في العمود اللوني وتوازنه مع المخزن المؤقت للموازنة (مثل برنامج تلفزيوني يحتوي على 20 ملم إيميدازول).
تحميل العينة: تحميل المادة طافية من المحللة البكتيرية على العمود اللوني، مما يسمح لـ IGF-1 LR3 بعلامته بالربط مع أيونات النيكل.
الغسيل: اغسل عمود الفصل اللوني باستخدام عازل الغسيل (مثل برنامج تلفزيوني يحتوي على 50 ملي مولار إيميدازول) لإزالة بروتينات الشوائب غير المرتبطة أو المرتبطة بشكل ضعيف.
شطف: استخدام شطف العازلة (مثل برنامج تلفزيوني يحتوي على 250 ملي إيميدازول) لأزل IGF-1 LR3 منضمة إلى العمود اللوني، وجمع شاطف.
تحلية المياه والتركيز
يحتوي محلول IGF-1 LR3 بعد الشطف على تركيز عالٍ من الإيميدازول، والذي يجب إزالته من خلال خطوات التحلية والتركيز لزيادة تركيز البروتين.
تحلية المياه: استخدم عمود تحلية المياه أو كيس غسيل الكلى لإزالة الإيميدازول من الشاطف واستبداله بمحلول منظم مناسب (مثل PBS).
التركيز: يتم تركيز محلول البروتين المحلى باستخدام أنابيب الترشيح الفائق أو مركزات الطرد المركزي لزيادة تركيز البروتين إلى المستوى المطلوب.
اختبار النقاء والنشاط
تم اكتشاف نقاء ونشاط IGF-1 LR3 المنقى بواسطة طرق SDS-PAGE أو HPLC أو ELISA.
SDS-PAGE: تحليل نقاء البروتين المنقى والتأكد من عدم وجود نطاقات شوائب واضحة.
HPLC: استخدم HPLC للمرحلة العكسية أو HPLC لاستبعاد الحجم لمزيد من التحليل للنقاء وتوزيع الوزن الجزيئي للبروتينات.
ELISA: يتم استخدام مقايسة الامتصاص المناعي المرتبط بالإنزيم (ELISA) للكشف عن النشاط البيولوجي لـ IGF-1 LR3، وينعكس مستوى نشاطه بدرجة ارتباطه بأجسام مضادة محددة.
عملية التجفيف بالتجميد
مبدأ التجفيف بالتجميد
التجفيد هو تقنية تجفيف تعمل على إزالة الرطوبة من خلال التجميد بدرجة حرارة منخفضة-والتسامي الفراغي. تشتمل عملية التجفيف بالتجميد- على ثلاث مراحل: ما قبل التجميد، والتجفيف بالتسامي، والتجفيف بالامتزاز، مما يؤدي إلى زيادة نشاط واستقرار البروتين.
خطوات التجفيف بالتجميد
قم بتقسيم محلول IGF-1 LR3 المنقى إلى زجاجات تجفيف بالتجميد أو زجاجات بنسلين، ثم ضعها في مجفف تجميد لتجميدها مسبقًا تحت -40 درجة لتجميد المحلول تمامًا.
ارفع درجة الحرارة تدريجيًا إلى حوالي -20 درجة تحت ظروف الفراغ، مما يسمح للثلج بالتصاعد مباشرة إلى بخار الماء وإزالة معظم الرطوبة. في هذه المرحلة، من الضروري التحكم في معدل التسخين ودرجة الفراغ لتجنب تمسخ البروتين أو انهياره.
قم أيضًا برفع درجة الحرارة إلى 20-30 درجة لإزالة الرطوبة المتبقية وتقليل محتوى الرطوبة للمنتج المجفف بالتجميد إلى أقل من 1%. في هذه المرحلة من الضروري الحفاظ على درجة عالية من الفراغ لضمان الإزالة الكاملة للرطوبة.
بعد اكتمال التجفيف، أغلق زجاجة التجفيف بالتجميد أو زجاجة البنسلين بسرعة-لمنع دخول الرطوبة مرة أخرى.
واقي للتجفيف بالتجميد
لحماية نشاط واستقرار IGF-1 LR3 أثناء التجفيف بالتجميد-، من الضروري عادةً إضافة مواد حماية للتجفيف بالتجميد-. تشمل مواد الحماية الشائعة للتجفيف بالتجميد ما يلي:
- الكربوهيدرات: مثل الجينات والسكروز والجلوكوز وغيرها، يمكن أن تشكل هياكل زجاجية وتثبت تكوين البروتين.
- يمكن للبوليمرات مثل البولي إيثيلين جلايكول (PEG) والبولي فينيل بيروليدون (PVP) أن تزيد من لزوجة المحاليل وتقلل من تراكم البروتين.
- يمكن للأحماض الأمينية، مثل الجلايسين والألانين، أن تعمل كمستقبلات أو مانحين لرابطة الهيدروجين، مما يعمل على استقرار بنية البروتينات.
- يمكن للمواد الخافضة للتوتر السطحي مثل Tween 20 وTween 80 وما إلى ذلك تقليل امتصاص البروتينات على جدران الحاوية وتحسين معدلات الاسترداد.
بأخذ الترهالوز كمثال، تبلغ كمية إضافته عادة 1-10 أضعاف كتلة البروتين، والتي يمكن أن تشكل طبقة واقية أثناء التجفيف بالتجميد لمنع تمسخ البروتين.
تحسين عملية التجفيف بالتجميد
يعد تحسين عملية التجميد والتجفيف-أمرًا بالغ الأهمية لتحسين جودةIGF-1 LR3 مجفف بالتجميد. من خلال ضبط المعلمات مثل درجة حرارة ما قبل التجميد، ودرجة حرارة التجفيف بالتسامي، ودرجة حرارة التجفيف التحليلي، ودرجة الفراغ، يمكن تحقيق أفضل تأثير تجفيف للتجميد-.
درجة حرارة ما قبل التجميد
يجب أن تكون درجة حرارة ما قبل التجميد أقل من نقطة الانصهار للبروتين لضمان التجميد الكامل للمحلول. عادة، يتم اختيار درجات حرارة أقل من -40 درجة.
درجة حرارة التجفيف التسامي
يجب أن تكون درجة حرارة تجفيف التسامي أقل من درجة حرارة انهيار البروتين لتجنب تمسخ البروتين أو انهيار الحاوية. عادة يتم اختيار حوالي -20 درجة.
تحليل درجة حرارة التجفيف
يجب أن تكون درجة حرارة تجفيف التحليل أعلى من درجة حرارة تجفيف التسامي لإزالة الرطوبة المتبقية. عادة، يتم اختيار 20-30 درجة.
درجة الفراغ
يجب الحفاظ على درجة الفراغ عند مستوى منخفض (مثل<100 mTorr) to promote the sublimation and removal of moisture.
الوسم : Igf-1 lr3 مجفف بالتجميد، الصين Igf-1 lr3 مجفف بالتجميد المصنعين والموردين, مسحوق CJC 1295, بخاخ CJC 1295, كبسولة IGF 1 LR3, حقن إيباموريلين, حقن MT2, قطرات سيرموريلين
